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Chapitre 4
La génétique

 

 
   

Biotechnologie

 

La biotechnologie est l'utilisation de microorganismes à des fins utiles. Elle est pratiquée depuis fort longtemps,mais a connu un essor dernièrement avec le développement de la biologie moléculaire.

 

 

Biotechnologies traditionnelles

 

La fabrication du vin, du pain, du yogourt, du fromage et toutes les autres fermentations alimentaires sont des exemples de biotechnologie qui ne datent pas d'hier et qui se font encore aujourd'hui.

 

 
Vin et fromage
 

Le vin, le pain et le fromage proviennent de la biotechnologie

(http://www.frucon.net/IMAG/GENE/PROD/NORM/GFEU0043.jpg)

 

 

Biotechnologies actuelles

 

Les biotechnologies basées sur les manipulations génétiques, le décryptage du génome et la modification génétique d'organismes (OGM) ont rapidement modifié la génétique de nombreuses espèces vivantes.

 

 

Génie génétique

 

Le génie génétique est un ensemble de techniques ayant pour but la modification des génotypes (donc des phénotypes) par le transfert de gènes d'un individu à l'autre (transgenèse). Cette technique permet aux cellules réceptrices d'acquérir de nouvelles propriétés qui peuvent provenir d'une espèce différente.

 

 
Génie génétique
 

Les résultats de la recherche sont parfois difficiles à maîtriser!

http://recherche-technologie.wallonie.be/servlet/Repository?IDR=754

 

 

Transgenèse

 

La transgenèse est une technique qui consiste à introduire un ou quelques gènes dans des cellules d'une même espèce ou d'une espèce différente. Ces nouveaux gènes seront transmis aux générations suivantes pour former des organismes génétiquement modifiés (OGM) ou organismes transgéniques.

 

 

Le transfert d'un gène se fait en six étapes :

 

 
Transgénèse
 

Transgenèse végétale

http://www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/08/transgeniccrop.gif

 

 

Extraction d'ADN

 

La première étape consiste à extraire l'ADN contenu dans des cellules ou des tissus. L'extraction d'ADN peut se faire selon différentes méthodes qui comprennent généralement les étapes suivantes :

  • Lyse des cellules (on brise les membranes afin le libérer de contenu cellulaire)
  • Élimination des membranes, organites et protéines
  • Élimination des autres acides nucléiques à l'aide d'ARNases
  • Concentration de l'ADN

 

 
Extraction d'ADN
 

Extraction d'ADN

(http://www.fuji-sciences.com/img/shema_QG.jpg)

 

 

Extraction de plasmides

 

La seconde étape consiste à extraire les plasmides.

 

 

Plasmide

 

Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire distincte du chromosome qui est capable de réplication autonome. On peut en retrouver des centaines de copies dans les bactéries. Certains plasmides contiennent des gènes de résistance aux antibiotiques que les bactéries peuvent échanger par un procédé nommé conjugaison. Les bactéries peuvent également acquérir de nouveaux plasmides par la transformation.

 

 
Plasmide
 

Plasmide

(http://www.gnis-pedagogie.org/img/doc2/plasmide.gif)

 

 

Dans notre exemple, le plasmide contient un gène de résistance à l'antibiotique ampicilline (ampr) et un gène permettant à la bactérie d'hydrolyser le lactose (lacZ). Le site de restriction de l'enzyme ECOR1 est situé dans le gène lacZ.

 

 
Plasmide
 

Plasmide contenant les gènes ampr et lacZ et le site de restriction EcoR1

 

 

Extraction

 

L'extraction d'ADN plasmidique se fait généralement par la technique de la lyse alcaline. Elle permet d'isoler spécifiquement l'ADN plasmidique en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Elle se fait généralement de la façon suivante :

  • Lyse des cellules à l'aide d'un détergent à pH 13.
    • L'ADN est dénaturé (les deux brins se séparent) à ce pH élevé.
  • La neutralisation rapide fait en sorte que l'ADN tente de se rapparier.
    • L'ADN chromosomique étant très long n'arrive pas à se rapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles.
    • L'ADN plasmidique plus court arrive à se reformer et demeure en solution.
  • Séparation des composants cellulaires par centrifugation.
    • Les membranes, les protéines et l'ADN chromosomique vont précipiter.
    • Les plasmides demeureront dans le surnageant.
    • Les ARN sont éliminés par des ribonucléases.
  • L'ADN plasmidique est concentré par précipitation à l'alcool ou à l'aide d'une colonne chromatographique échangeuse d'ions.

 

 
Etraction de plasmide
 

Extraction de plasmides

(http://www1.qiagen.com/products/Plasmid/

CompactPrep/images/fc_CompactPrep.gif)

 

 

Digestion par des enzymes de restriction

 

Une fois l'ADN chromosomique et plasmidique isolés, on doit les couper à l'aide d'enzymes de restriction. Ceci permettra de couper l'ADN chromosomique en plusieurs morceaux plus ou moins longs. Le plasmide ne sera coupé qu'à un endroit (dans le gène lacZ) ce qui aura pour effet de l'inactiver.

 

 

Enzymes de restriction

 

Les enzymes de restriction reconnaissent spécifiquement certaines séquences d'ADN (site de restriction) puis coupent la molécule d'ADN en donnant généralement des extrémités cohésives. Les sites de restriction sont généralement des palindromes, c'est-à-dire des textes qui peuvent se lire dans les deux sens (comme le mot Laval ou " Ésope reste ici et se repose " ou " un art luxueux ultra nu " ou un palindrome de 1247 mots!).

 

L'enzyme de restriction EcoR1 (la première à avoir été découverte chez Escherichia coli) reconnaît la séquence GAATTC et a inspiré une chanson du groupe Radicaux libres (n=1).

 

 
Enzyme de restriction
 

Enzyme de restriction

http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/

SrSemMedEthics/Human%20Genome%20Project/restriction.gif

 

 

Ligation

 

La ligation consiste à relier des molécules d'ADN à l'aide de l'enzyme ADN ligase qui forme des liaisons phosphodiester entre les nucléotides. La ligation reforme une molécule d'ADN bicaténaire.

 

 
Ligation
 

Ligation

(http://www.promega.com/enotes/features/9910a/images/Rapidlig2.jpg)

 

 

Dans la figure suivante, l'ADN ligase fera les liens entre les nucléotides adénine.

 

 
Ligation
 

Ligation de l'ADN

(Wikipedia)

 

 

Dans notre exemple, la ligation permet de former trois types de molécules d'ADN :

  • Des plasmides reconstitués qui donneront des bactéries résistantes à l'ampicilline et lac+ (capable d'hydrolyser le lactose)
  • Des plasmides recombinés qui donneront des bactéries résistantes à l'ampicilline et lac- (incapables d'hydrolyser le lactose)
  • Des molécules d'ADN humain circulaires qui donneront des bactéries sensibles à l'ampicilline

 

 
plasmide reconstituéPlasmide recombinéADN étranger

Plasmide reconstitué (gauche), plasmide recombiné (centre) et ADN étranger circulaire (droite)

 

Transformation

 

Une fois la ligation terminée, on mélange la solution de plasmides avec une solution de bactéries. La transformation est un des moyens, pour les bactéries, d'acquérir du nouveau matériel génétique. Lorsque de l'ADN bicaténaire est libre dans une solution bactérienne, les bactéries le font pénétrer. Ce processus n'étant pas efficace à 100 %, on retrouvera dans le mélange des bactéries transformées (ayant incorporé un plasmide) et des bactéries non-transformées.

 

 
Transformation
 

Transformation d'une bactérie

http://www.biology.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/

Recombinant_DNA_Technology/graphics/05t.gif

 

 

Sélection et criblage

 

Sélection

 

Une fois la transformation réalisée, on doit d'abord sélectionner les bactéries ayant reçu un plasmide. Pour ce faire, on ajoute un antibiotique au milieu de culture. Seules les bactéries transformées ayant le gène de résistance à l'antibiotique vont pouvoir pousser sur le milieu. Les bactéries non transformées ne pourront pas se développer puisqu'elles n'auront pas le gène de résistance.

 

 
Sélection
 

Sélection à l'aide d'un milieu contenant un antibiotique

http://openwetware.org/images/thumb/2/2f/

Be109transformation.jpg/200px-Be109transformation.jpg

 

 

Dans notre mélange, on retrouvera trois types de bactéries :

  • les bactéries non-transformées qui seront tuées par l'antibiotique
  • les bactéries avec un plasmide reconstitué qui seront résistantes à l'antibiotique dont le gène lacZ sera intact qui donneront des colonies bleues
  • les bactéries avec un plasmide recombiné qui seront résistantes à l'antibiotique, mais dont le gène lacZ sera désactivé par l'introduction d'ADN étranger qui donneront des colonies blanches.

 

 

 

 

Sélection

http://www.biology.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/

Recombinant_DNA_Technology/05t.html

 

Criblage

 

Dans notre exemple, on repique ensuite les colonies blanches puisqu'elles ont de l'ADN exogène. On doit maintenant rechercher les bactéries ayant un plasmide contenant le gène recherché. Pour ce faire, on peut utiliser des anticorps spécifiques à la protéine recherchée ou des sondes radioactives. Ces sondes sont des molécules d'ADN monocaténaires contenant des atomes radioactifs ayant une séquence complémentaire à une partie du gène recherché. On transfert les bactéries sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose (en déposant tout simplement la membrane sur le Petri). On fait chauffer puis tremper la membrane dans une solution contenant des sondes radioactives. En diminuant la température, les sondes pourront se fixer sur la partie de l'ADN ayant une séquence complémentaire, c'est ce que l'on nomme hybridation. Un rinçage permet de retirer les sondes qui ne se seront pas hybridées. Comme les sondes contiennent des atomes radioactifs, on peut procéder à une autoradiographie. C'est-à-dire que l'on dépose la membrane sur un film radiographique pendant quelques jours dans le congélateur puis on développe le film. Les atomes radiographiques réagiront avec le film ce qui permettra d'identifier les colonies contenant le gène recherché.

 

Pourquoi doit-on exposer

le film dans le congélateur.?

 

Criblage

http://www.biology.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/

Recombinant_DNA_Technology/05t.html

 

 

Vue d'ensemble du clonage de gène

 
Transgénèse

Vue d'ensemble du congé de gène

http://www.scq.ubc.ca/images/plasmid2-texthr.gif

 

 

Électrophorèse

 

L’électrophorèse est utilisée en biologie moléculaire pour la séparation et la caractérisation des acides nucléiques ou des protéines.

 

 

Cette technique est basée sur le déplacement de molécules ioniques sous l'effet d'un champ électrique. Les molécules anioniques (chargées négativement) migrent vers la cathode et les molécules cationiques (chargées positivement) se déplacent vers l'anode. L'ADN est une molécule chargée négativement qui se déplacera donc vers la cathode. Les plus petites molécules pourront plus facilement se frayer un chemin dans le gel d'agarose et migreront plus loin. Les plus grosses molécules resteront plus près des puits.

 

 
Électrophorèse
 

Vous pouvez réaliser l'électrophorèse dans votre cuisine!

http://www.ndpteachers.org/perit/Electrophoresis%20%5B1%5D.gif

 

 

Réaction en chaîne par polymérase

 

La réaction en chaîne par polymérase (Polymerase Chain Reaction ou PCR en anglais) est une méthode d'amplification d'ADN qui permet, à partir d'un très petit échantillon, de fabriquer un grand nombre de copies rapidement. Elle permet le diagnostic en médecine ou l'identification de bactéries ou des virus par exemple. On l'utilise également en criminologie.

 

Quel est le rapport entre

Yogi l'ours et le PCR?

 

Yogi l'ours

 

(http://www.montrealultimate.ca/

images/indoor/yogi6_small.jpg)

Cette technique consiste à introduire un échantillon d'ADN dans un microtube contenant des nucléotides (A, C, G et T), des amorces (sondes) et l'enzyme ADN polymérase thermorésistante. Cette enzyme a été isolée de bactéries thermophiles. Une amorce (ou sonde) est une courte molécule d'ADN monocaténaire que l'on peut fabriquer spécifiquement au besoin. On dépose le tube dans un thermocycleur qui fera varier périodiquement la température.

 

Phase de dénaturation

 

On chauffe le tube à 95 °C pendant quelques minutes. Ceci permet de dénaturer l'ADN (séparer les deux brins), d'homogénéiser la solution, d’activer l'ADN polymérase et de dénaturer les autres enzymes.

 

 

Phase d'hybridation

 

On abaisse la température à 56-64 °C pendant environ 1 minute. Ceci permet aux amorces de s’hybrider à l'ADN complémentaire. Les amorces étant plus courtes et en plus grande concentration que l'ADN chromosomique, elles peuvent s'hybrider plus rapidement.

 

 

Phase d’élongation

 

Pendant cette étape qui se déroule à 72 °C pendant 1 ou 2 minutes, l'ADN polymérase synthétise un brin complémentaire pour chaque fragment d'ADN matrice à partir des nucléotides libres se trouvant dans le tube. L'ADN polymérase a besoin d'une région bicaténaire pour ajouter des nucléotides. La synthèse débute donc lorsqu'une amorce s'est hybridée à l'ADN. En fait, ce sera la partie de la molécule d'ADN située entre les amorces qui sera amplifiée.

 

 
PCR
 

Étapes du PCR

(http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif)

 

 
PCR
 

La réaction en chaine par polymérase (PCR)

(http://scienceblogs.com/insolence/upload/2007/06/PCR.jpg)

 

 

Séquençage d'ADN

 

Le séquençage d'ADN consiste à déterminer l'ordre des nucléotides d’une molécule d’ADN. Elle se fait généralement par la méthode de Sanger qui utilise la réaction de polymérisation de l’ADN (tout comme le PCR) avec la différence que l'on ajoute des nucléotides modifiés nommés didésoxyribonucléotides (ddNTP) dans le tube. Les nucléotides modifiés sont en moins grande concentration que les nucléotides normaux.

 

 
didésoxyribonucléotides
 

Didésoxyribonucléotide

(http://campus.queens.edu/faculty/jannr/Genetics/

images/dnatech/FG12_12aDideoxy.JPG)

 

 

L'ADN polymérase ajoute des nucléotides jusqu'à l'ajout d'un didésoxyribonucléotide qui stoppe la synthèse, l'enzyme ne pouvant ajouter de nucléotide à un didésoxyribonucléotide (il n'y a plus de fonction hydroxyle). On obtient donc une série de molécules d'ADN plus ou moins longues dans le tube.

 

 
Séquencage
 

(http://campus.queens.edu/faculty/jannr/Genetics/

images/dnatech/FG12_12aDideoxy.JPG)

 
Séquencage
 

Séquençage de l'ADN

(Wikipedia)

 

 

On sépare toutes ces molécules par électrophorèse. Chacun des didésoxyribonucléotides est marqué avec un colorant fluorescent spécifique. On éclaire le gel à l'aide de lumière à une certaine longueur puis on mesure la fluorescence à l'aide d'un détecteur. On analyse les données à l'aide d'un ordinateur qui détermine la séquence d'ADN.

 

 
Séquencage
 
(http://spiral.univ-lyon1.fr/polycops/BiologieMoleculaire/Shema39.jpg)  
Séquencage
 

Exemple de résultat de séquençage

(http://ib.berkeley.edu/labs/lacey/new/old_site/electro.JPG)

 

 

Hybridation fluorescente in situ

 

L'hybridation fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridization ou FISH en anglais) est une technique qui utilise des sondes marquées par fluorescence. Ces sondes peuvent être soit de l'ADN, soit des anticorps sur lesquels on a fixé un colorant fluorescent. On traite une préparation microscopique avec les sondes qui se fixeront spécifiquement et permettront d'identifier rapidement une protéine ou un gène spécifique.

 

 
FISH
 

Technique FISH (A) sonde (B) sonde marquée par fluorescence

(C) hybridation (D) observation de la fluorescence au microscope

(Wikipedia)

 

 

Caryotype spectral (technique SKY: Spectral Karyotype).

 

Cette technique utilise différentes sondes spécifiques (voir FISH) pour chaque chromosome qui sont marquées avec des proportions variables de cinq fluorochromes différents que l'on hybride avec les chromosomes d'une cellule. Ceci donne une coloration spécifique pour chaque chromosome et facilite grandement la réalisation de caryotypes. Elle permet d'identifier rapidement les anomalies chromosomiques.

 

 
SKY
 

Technique SKY

(Wikipedia)

 

 

Empreinte génétique

 

L'analyse d'empreinte génétique permet d'identifier un individu à partir d'un petit échantillon d'ADN (sang, salive, poils ou sperme par exemple). On l'utilise également dans les tests de paternité. Même si deux humains ont une grande proportion d'ADN identique, chaque personne possède des séquences d'ADN spécifiques.

 

 
Empreinte génétique
 

Empreinte génétique

http://www.scq.ubc.ca/wp-content/DNAfingerprintfamily.gif

 

 

Organismes génétiquement modifiés (OGM)

 

Un organisme génétiquement modifié ou OGM est être vivant dont le génome a été modifié par génie génétique. Les OGM sont très cultivés en Amérique et en Chine et sont boudés en Europe.

 

 
Culture des OGM  

Pays cultivant des OGM (en 2005)

(Wikipedia)

 

 

La création d'un OGM se réalise en 4 étapes :

 

 

Identification, isolation, intégration et multiplication du gène d'intérêt

 

On doit d'abord identifier le caractère que l'on désire introduire dans une plante, comme la résistance à certains insectes ou à certains herbicides. Le gène d'intérêt peut provenir d'un organisme de la même espèce ou d'une autre espèce. Le gène est isolé puis intégré dans un plasmide.

 

 

 

Transfert du gène

 

On doit ensuite introduire le gène dans la plante d'intérêt commercial. On utilise souvent une bactérie du sol nommée Agrobacterium qui transfert les gènes dans le génome de certaines cellules de la plante.

 

 

Régénération et évaluation des plantes transgéniques

 

Une fois le transfert de gène réalisé, on doit faire pousser les nouvelles plantes transgéniques. On s'assure que les plantes expriment correctement le ou les gènes transférés. On sélectionne les plantes qui expriment le mieux les gènes d'intérêt.

 

 

Incorporation du gène dans une variété commerciale

 

On effectue finalement divers croisements pour s'assurer que les nouveaux gènes se transmettent à la descendance afin de produire une grande quantité de graines et assurer une bonne activité commerciale.

 

 
OGM

Le site ogm.gouv.qc.ca

fait le point sur l'utilisation

des OGM au Québec.

Fabrication d'OGM

(http://www.ogm.org/pages/show.php?cat=11&idcomm=95)

 

 
OGM
 

Il faut être prudent avec les manipulations génétiques...

http://www.ahajokes.com/cartoon/cloning.jpg